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抗菌剂在抗菌涂料中的应用研究研究了商业主要抗菌剂的抗菌性能艾晴晴

2022-09-22 14:01:34

抗菌剂在抗菌涂料中的应用研究，研究了商业主要抗菌剂的抗菌性能

0 前言

使用抑菌圈(之前使ASTM G-22)及JIS Z 2801的方法研究商业涂料的抗菌性能。测试中使用了五种微生物：金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u saureus),沙门氏菌(Salmonella choleraesius),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)及肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellap n e umo n i a e)。结果显示只有一种品牌的涂料及一种“品牌标识”的涂料能够提供良好的广谱抗菌性能,包括防止细菌生长及减少细菌数量

为明确哪种商业杀菌剂提供杀菌性,六种常见的具有抗霉性能的商用干膜杀菌剂被选择做此实验：吡啶硫酮锌 (Z P T),3-碘-2-炔丙基丁基氨基甲酸酯 (I P B C),2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮 (O I T), 4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮(D C O I T)和 N-正丁基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(B B I T),仅被看作抗细菌剂的银杀菌剂也被包括在内。测试显示吡啶硫酮锌可提供良好的生物稳定性及杀菌性能以对抗所有的被测试细菌。对干膜来说银是其次较好的杀菌剂。吡啶硫酮锌的抗菌性能通过在粉刷后的墙上而进一步测试,通过一个月对其施加广谱微生物结果的监测发现其仍然有作用。此研究证实了将抗菌涂料涂装在基材上可以提供抗微生物性能,特别是抗细菌性[1-4]。

1 抗菌性能测试

EPA和BPD都没有发布测试抗菌涂料效果的标准方法,许多工业团体如A S T M,I S O,J I S等发布了它们自己主要用于确定无孔材料的抗微生物剂活性的标准方法,其中很多方法被采用来测试涂膜的杀菌效果。商业上惯用基于扩散区域分析以确定被处理产品防止微生物生长的定性抗菌测试。抗菌效果通过接种或划线过细菌的营养琼脂上形成的抑菌圈大小来评定。此方法通常用于评估抗生素效力[5]。图1阐明了抑菌圈方法。

抑菌圈测试法测试涂层抗菌性

对定量评估上,日本工业标准(J I S)Z2801:2000及A S T M E2180-01都是使用最广泛的。在J I SZ2801方法中,涂层表面接种细菌悬液并通过已灭菌的聚丙烯膜或盖玻片使其紧密接触一定时间,通常为24 h。只要求(但不限于)测试两种菌株：金黄色葡萄球菌(A T C C 6538#)和大肠杆菌(A T C C8739#)。抗菌活性值由抗菌产品和未经处理产品24 h接菌后的活菌数对数值的差异决定。通过测试的产品,其细菌对数减少量的值不应小于2.0。图2阐明了JIS方法。

抗菌产品：抗菌活性及效果测试—JIS Z 2801:2000—图解

A S T M E2180-01方法更多用于疏水性或硬表面物品的测试。它是另一用来评定抗菌涂料效果的定量方法。此方法与J I S方法类似。然而在A S T M方法中,菌悬液制作在琼脂浆液中,应用在测试表面上以形成假性-生物膜从而提供一种均匀紧密的接触。抗菌效果由处理过样品对未处理过样品的细菌减少百分数确定。

2 试验部分

6种商业抗菌涂料及6种抗菌剂的抗菌性由抑菌圈方法及J I S 2801方法对金黄色葡萄球菌(S.c.)、大肠杆菌(E.c.)、铜绿假单胞菌(P s.a.)、沙门氏菌(S.c)及克雷伯氏菌(K.p)进行评定。商用涂料包括3种有“处理条款”信息的店头品牌漆及3种具有“商品标识”的产品。测试的抗菌剂包括吡啶硫酮锌(ZPT),3-碘-2-炔丙基丁基氨基甲酸酯 (IPBC), 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮 (O I T), 4,5-二氯-2-正辛

基-4-异噻唑啉-3-酮(D C O I T), N-正丁基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(B B I T) 和银。这些抗菌剂通过添加在建筑涂料中进行测定。

2.1 样品准备

商用涂料按其原本的样子进行测试。除Z P T之外,其它抗菌剂按其制造商推荐的最低和最高浓度进行测试。每个样品在Whatman 934-AH 滤纸上进行双涂层,然后将其在涂料中干燥24 h。之后将涂层滤纸切成1英寸直径大小进行使用。每种样品系列在流动的水中浸滤24 h并在进行抗菌测试之前至少干燥24 h。测试重复三次。

2.2 抑菌圈测试

0.1 m L的菌悬液分散在含凝固胰酶大豆琼脂(T S A)的培养皿上。将各涂层样品放在培养皿的中间,置30 ℃培养24 h。由于杀菌剂渗透出来抑制了细菌生长的涂层样品附近区域,在培养的过程中细菌生长并繁殖生成一大片菌落完全把培养基的表面覆盖住了,涂层样品附近生成一个“晕环”或“抑制圈”(Z)。从样品边缘到Z区外缘的距离(测量到毫米)及澄清的Z区都指示了杀菌剂抑制细菌生长的效果。没有Z区的样品表明其无生物稳定性或者该杀菌剂无法渗透到培养基上。培养后有抑菌圈的样品测量其区域并对透明的Z区进行纪录。

2.3 JIS 2801测试

将0.1 m L24 h制备的菌悬液接种到各涂层滤纸表面。对于“0 h接触时间”,在菌液施加到样品表面后立刻用10 mL已灭菌的李氏肉汤冲洗。对“24 h接触时间”,在菌液施加到样品表面后将无菌盖玻片盖在接种体表面,置30 ℃培养24 h；之后用10 m L已灭菌的李氏肉汤冲洗。冲洗液中的活菌数通过在胰酶大豆琼脂(T S A)进行系列稀释来确定。若要通过测试,细菌减少量的l o g值应小于2。对数细菌减少量计算通过图3进行说明。

细菌减少量对数值

2.4 漆面墙的抗菌测试

我们对ZPT在多种内墙涂料中的抑菌效果进行了研究。测试中第一组涂料为丙烯酸亚光漆,丙烯酸,环氧；第二组由半光漆组成。每种涂料粉刷在80 cm×80 cm的墙面上后接种各种细菌及真菌。每周墙被擦拭并对其细菌/真菌计数。测试的微生物如下：

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (B.s)

沙门氏菌Salmonella choleraesius (S.c)

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (S.a)

大肠杆菌Escherichia coli (E.c.)

产气肠杆菌Enterobacter aerogenes (E.a)

耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis (M.s)

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa (P.a.)

粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis (A.f)

须癣毛癣菌Trichophyton mentagrophytes (T.m)

青霉菌Penicillium pinophilum (P.p)

混合细菌Pool of mixed bacteria

混合真菌Pool of mixed fungi

混合真菌与细菌Pool of fungi and bacteria

3 结果与讨论

此研究中的抗菌性能评估基于抑菌圈及J I S 2801测试方法。发现为使测试方法可应用于涂料抗菌性能的评估,有很多变量是应被考虑进来的。首先应该考虑的变量是用于涂层的基质。J I S 2801要求使用无孔基质。盖玻片直到沥滤和浸水是常用和实用的。但由于应用的涂料可能脱落而产生了问题。理想情况下,两种评估的抗菌测试应使用相同的基质。为了选择理想的基质,对松木、934-A H滤纸及盖玻片进行了评估。松木及滤纸是常用的抗真菌测试基质。通过对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌大肠杆菌的作用来评估这些不同基质涂层的功效。表1和表2中显示：盖玻片和滤纸产生了相似的结果并有比松木更好的重现性。木片涂层产生了比其他两种基质更好的细菌对数减少值,这说明细菌在木片涂层表面的黏附性强而且在冲洗过程中不易有效释放在李氏溶液中。出于实用性,被应用于余下的实验中。

基质在抑菌圈(ZOI)方法中对抗菌测试的影响

基质在JIS 2801方法中对抗菌测试结果的影响

在此试验中,对J I S 2801中使用的杀菌剂中和剂的效果也做了研究。若中和剂在J I S的测试中确实具有非常重要的作用,溶解性好的杀菌剂应比溶解性差的杀菌剂具有更好的杀菌效果。B B I T的水溶性为400×10-6左右,而ZPT大概为6×10-6。BBIT用硫代硫酸钠中和；Z P T用硫代硫酸钠和巯基乙酸钠的混合物进行中和。表2的结果显示中和剂的影响很小。J I S中的细菌提取可以在没有中和剂的情况完成。之后此研究中没有使用中和剂。

3.1 罐内防腐

我们测试的许多防腐涂料都产生了抑菌圈和减少细菌数量的效果。这个发现因干膜抗菌剂的作用变得无关而使得测试有效性变复杂。为确保这些干膜抗菌性的“真实有效”,我们选择了一部分涂料并使其浸滤了24 h。浸滤过和未浸滤过的涂料的抗菌效果在表3和图4中进行了比较。结果显示浸滤减少了罐内防腐引起的干涉。浸滤洗掉了涂料中有机可溶材料初始显示的“假性-抗菌效果”。

罐内防腐剂在抑菌圈测试中对抗菌测试结果的影响

罐内防腐在JIS 2801抗菌测试中对结果的影响

3.2 膜厚

一种典型的普通建筑涂料及几种商用涂料按不同膜厚度涂覆在了滤纸上。没有进行膜厚度测量,而改为用实施涂层的次数(一或两层)区别膜厚度。对两种涂料的评估显示,涂层厚度对抑菌圈测试的结果影响不大,见表4。类似结果还出现在J I S 2801测试中,见图5。细菌对数减小数值并非精确值而是概数,而且二者的涂层展现了相似的抗菌性趋势。清楚影响抗菌测试结果的变量非常重要。此研究显示罐内防腐剂及涂料中有机溶解性的物质可以在琼脂基质中进行扩散或可溶于李氏溶液中从而产生假性-抗菌结果。此影响可被最小化,而且为证实涂层抗菌效果浸滤是应被考虑的因素。同时应使用无防腐剂的涂料作为“阴性控制”。最后,无孔基质对这两个测试来说是较好的基质。考虑到在防霉测试中可以用相同的基质,我们选择了滤纸。由于膜厚度的影响不大,我们用两层涂层确保测试的一致性。

膜厚在抑菌圈测试中对结果的影响

膜厚在JIS 2801抗菌测试中对结果的影响

4 抗菌剂抗菌性能评估

在此研究中,除Z P T之外,其它抗菌剂按其内用涂料制造商推荐的最低和最高浓度加入常用丙烯酸亚光漆进行测试。Z P T在760×10-6～1 520×10-6范围的中间浓度进行测试。表5中只报告了用J I S 2801评估的浸滤过的样品。结果显示,除I P B C外,其它抗菌剂都显示了抵抗细菌的功效。异噻唑啉基抗菌剂特别是OIT和BBIT提供了相似的抗菌防护水平,且在提供广谱杀菌效果时最高浓度是必需的。ZPT及银在最低测试浓度下就有效。表6中总结的抑菌圈测试结果证实了I P B C不能提供广谱抑制细菌生长的效果。在对S.a、K.p 和E.c.进行涂料测试时出现了细菌生长。其它抗菌剂如OIT和BBIT提供了相似水平的抗菌行为。ZPT对测试的5种菌中的4种形成了抑菌圈,银未形成任何抑菌圈。

JIS2801方法测试浸滤后涂料中不同杀菌剂的抗菌性

抑菌圈方法测试涂料中不同杀菌剂的抗菌性

综合以上2种抗菌测试的结果,只有Z P T可对测试的5种菌种提供强力持久的抵抗性。银是另一种被证明能提供抗菌性的抗菌剂,尽管其生物稳定性不是太好。

5 有抗菌涂料墙面的抗菌性测试

通过进一步的测试来确定Z P T的效果。含有Z P T的不同涂料被粉刷到模拟真实生活条件的内墙上,并在其上接种微生物。由于抑菌圈及JIS 2801的方法都没法采用,细菌活性通过每周从墙壁上转移活菌数至营养琼脂进行监测,共实行4周。所有第一组中未添加杀菌剂的涂料都没有展现任何抗菌性；所有测试微生物及环境污染都在其表面生长。相反,只有从环境中收集到的真菌污染物在用Z P T处理过的少数第一组涂料中被测出,而未发现任何测试菌生长。从亚光到弱反光涂料,Z P T在1 900×10-6下对多种细菌和真菌都有效。在第二组,半光漆,被发现对细菌的生长的敏感性下降。只有金黄色葡萄球菌(S.a)和耻垢分枝杆菌 (M.s) 在无杀菌剂的涂料中生长。额外添加的浓度在950×10-6的Z P T可提高此涂料的抗菌性。

6 结论

此研究结果表明加入合适量的杀菌剂,抗菌涂料在防止或减少细菌生长方面被证明是有效的, Z P T被证明是杀菌效果最好且最广谱的杀菌剂。Z P T对真菌和藻类的有效性是众所周知的。银是另一种有效的杀菌剂,虽然其表现不如Z P T强,且其对真菌的效果还需确认。其他异噻唑啉基的杀菌剂被证明具有有限的杀菌性。涂料配方在决定杀菌剂用量方面也起到了非常重要的作用。半光漆与添加更多量颜料的涂料相比对细菌生长的敏感性更低。